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引物退火

在PCR体系中精确确定引物退火时间的公式为: 1、当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT 2、对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为: Tm = 81.5 + 16.6 x Log10 + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中,Tm表示退火时间,Size = 引物长度。 退火,主要是...

退火温度越高,断开氢键的热能越大,引物与模板越不易结合,反之,退火温度越低,越容易形成氢键,进行退火。所以当温度高时,只有碱基匹配程度高的,也就是模板与引物形成配对数越多的引物,才能结合到模板上,这样扩增出来的条带最少,甚至只...

预变性 模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟. 变性步骤 循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间 变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易...

加热使DNA双螺旋解开,在一定的条件下,两条互补的单链依靠彼此的碱基配对重新形成双链DNA的过程,亦即复性过程。热变性的DNA单链在缓慢冷却过程中可以达到很好的退火。退火的两条单链可以来自同一个双链的DNA分子,也可以来自不同的DNA分子。退...

1.一般来说,较低的退火温度可以提高pcr反应的敏感性但特异性较差;而较高的退火温度则可以提高pcr的特异性但却降低了扩增效率。通常引物与模板的退火温度在45-55度。 2.优化退火温度最好的方法是设置一系列对照反应,即通过在低于计算出的引物T...

在模板变性后温度快速冷却至40℃~60℃(某个退火温度)的时候,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞,这就使PCR后期的过程成为可能.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基...

计算退火温度的方法: 1. 退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5~8) 只是粗算,有时不灵,但比较简便。 2.用primer5(or oligo6)计算,引物配对好后,primer5可以显示Tm,我认为这个值就是退火温度,我的经验再加2 or 3度最好。 3.合成引物...

PCR引物设计中的一个重要参数即是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定pcr退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合...

1、预变性(Initial denaturation)模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。 2、循环中的变性步骤循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情...

说影响得看情况,退火温度太高肯定会影响引物的结合效率的。但是,实际上,好的引物一般是上下游引物的退火温度比较接近。有时候,我们可能会通过牺牲特异性的手段(当GC含量过高时,减少引物长度)来平衡两条引物的退火温度。 高的退火温度是不...

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